El empleo de microalgas en procesos integrados de depuración de gases ha cobrado un especial interés en los últimos años, debido principalmente a su capacidad para capturar CO_2. Estas aplicaciones implican la generación de biomasa que puede utilizarse para obtener bioproductos y/o bioenergía, cuyo desarrollo requiere avanzar en métodos de ruptura celular y extracción de biocompuestos.

   El objetivo de este estudio fue evaluar un método de obtención de proteínas y aminoácidos libres (FAN) a partir de Chlorella vulgaris.

J.A. Callejo*, M. Ramírez, J. Bolívar, A. Valle y D. Cantero

Departamento de Ingeniería Química y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Ciencias. Universidad de Cádiz. Instituto Universitario de Investigación Vitivinícola y Agroalimentario (IVAGRO). Av. República Saharaui S/N. 11510 Puerto Real, Spain.  martin.ramirez@uca.es

   Conflictos de interés: El autor declara que no existe conflicto de intereses.

   Editor académico: Carlos N Díaz.

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   Cita: J.A. Callejo, M. Ramírez, J. Bolívar, A. Valle y D. Cantero, 2017, Obtención de proteínas y aminoácidos libres a partir de microalgas aplicables a la depuración de gases, IV Conferencia Internacional sobres gestión de Olores y COVs en el Medio Ambiente, Valladolid, España, www.olores.org

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   ISBN: 978-84-697-7359-8

   Palabras claves: Depuración de gases con Chlorella vulgaris, Lisis de la pared celular, Autolisis, Hidrolisis de proteínas, Extractos de proteínas y aminoácidos libres.

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Resumen

   El empleo de microalgas en procesos integrados de depuración de gases ha cobrado un especial interés en los últimos años, debido principalmente a su capacidad para capturar CO₂. Estas aplicaciones implican la generación de biomasa que puede utilizarse para obtener bioproductos y/o bioenergía, cuyo desarrollo requiere avanzar en métodos de ruptura celular y extracción de biocompuestos.

   El objetivo de este estudio fue evaluar un método de obtención de proteínas y aminoácidos libres (FAN) a partir de Chlorella vulgaris. El método evaluado, con biomasa fresca, consistió en dos fases secuenciales: i) una de ruptura de la membrana celular para liberar las proteínas, mediante una reacción enzimática con celulasa a una temperatura de 50ºC y pH 5, y ii) y otra de autolisis de las proteínas a FAN, a temperatura de 50ºC, durante 24 h, a diversos valores de pH. Para la optimización del método se empleó un diseño de análisis estadístico de superficie de respuesta de diseño central compuesto. Las variables evaluadas fueron el tiempo de duración de la reacción enzimática con celulasa, y el valor de pH del tratamiento térmico posterior.

   Las variables de respuesta a maximizar fueron el rendimiento de proteínas, de FAN y ambos conjuntamente. Los valores óptimos obtenidos fueron para proteínas, 3,5 h y pH 8,5; FAN, 2,9 h y pH 8,2; y para ambos de 3,3 h y pH 8,3. En la validación del modelo, bajo estas últimas condiciones, se obtuvieron unos rendimientos en proteínas y FAN del 14,4% y 0,33%, respectivamente, sobre biomasa seca.

1. Introducción

   En los últimos años ha aumentado de forma notable el interés por las microalgas para su aplicación en procesos integrados de depuración de efluentes líquidos y/o gaseosos, junto con la obtención de bioproductos y bioenergía (Razzak et al., 2013; Suganya et al., 2016; Yen et al., 2015). Chorella vulgaris en concreto se considera idónea para la depuración de gases debido a su elevada tolerancia a altas concentraciones de CO₂ (hasta del 15%) (Anjos et al., 2013; Chiu et al., 2008; Yun et al., 1997). Entre los bioproductos que pueden obtenerse de las microalgas producidas en estos procesos se incluyen las proteínas y aminoácidos para su uso en alimentación humana o animal, fertilizantes, medios de cultivo de microorganismos, etc. (Becker, 2007; Kightlinger et al., 2014; Romero García et al., 2012; Spolaore et al., 2006). En los estudios dedicados a la fracción proteica de las microalgas destacan los dirigidos a buscar mejores métodos de análisis (Barbarino and Lourenço, 2005; González López et al., 2010; Rausch, 1981; Slocombe et al., 2013) o evaluar factores de conversión de nitrógeno a proteína (González López et al., 2010; Lourenço et al., 2004, 2002, 1998; Safi et al., 2014). Las investigaciones con el objetivo de obtener proteínas, y su hidrólisis posterior a aminoácidos, son limitadas. Con este propósito, Romero García et al. (2012) optimizaron un proceso que consistió en un pretratamiento físico y una reacción enzimática con proteasas comerciales, a partir de Scenedesmus almeriensis. Morris et al. (2008) obtuvieron buenos resultados con pancreatina a partir de un extracto etanólico de Chlorella vulgaris. Kightlinger et al. (2014) aplicaron la autolisis (a 50ºC durante 24h) en Chlamydomonas reinhardti, una especie de pared celular poco resistente.

   El objetivo de este estudio fue evaluar y desarrollar un método de obtención de un extracto rico en proteínas y aminoácidos a partir de microalgas basado en la autolisis, precedido de un proceso enzimático de rotura de la membrana celular con celulasa, empleando biomasa fresca de Chlorella vulgaris, especie de pared celular resistente (Gerken et al., 2013). Para la optimización del método se ha empleado un análisis estadístico de superficie de respuesta de diseño central compuesto.

2. Materiales y métodos

 2.1 Biomasa de microalgas y condiciones de cultivo

   La especie de microalga empleada fue Chlorella vulgaris (SAG 211-12) (Universidad de Göttingen, Alemania). El cultivo se realizó en fotobiorreactores de vidrio de borosilicato (5 l), a temperatura ambiente, luz artificial con 4 tubos led (170 mol cm^-2 s^-1) y fotoperiodo 12/12 h. El aire y la fuente de carbono (CO₂ puro) se suministraron mezclados mediante burbujeo con un flujo continuo filtrado a 0,2 micras, en una proporción de CO₂ establecida en función del pH del cultivo (7,5-8,2). El medio de cultivo empleado fue Combo (Kilham et al., 1998), enriquecido 3 veces en nitrógeno y fósforo. El cultivo se realizó en modo semicontinuo, con un tiempo de residencia de 15,8 días, y una concentración de biomasa máxima de 0,9 g l^-1. El cosechado se realizó mediante centrifugación a 5.000 g durante 15 min a 4ºC. Los ensayos se realizaron con la biomasa fresca obtenida directamente de esta forma, y tras un pretratamiento manual con mortero durante 5 min, ya que ello mejoraba el rendimiento final de la extracción. Para los análisis de composición y los ensayos preliminares con biomasa seca se empleó biomasa liofilizada (Lyoalfa-85 3,5 kW, Telstar, España).

 2.2. Ensayos enzimáticos

   Los ensayos enzimáticos consistieron en dos reacciones secuenciales, una enzimática con celulasa (50ºC y pH 5) a diferentes tiempos, seguida de un tratamiento térmico (autolisis) a 50ºC (Tanguler and Erten, 2008) a diferentes pH, hasta una duración total de 24h. Para la reacción enzimática con celulasa se utilizó Celluclast 1.5 L (Novozymes), en una dosis de 0,1 ml g^-1. Los ensayos se realizaron en tubos de vidrio (5 ml) con biomasa fresca pretratada en suspensión con agua destilada a una concentración final en peso seco de 10 mg/ml (humedad del 75,7%). Los ensayos se realizaron en una incubadora orbital para alcanzar la temperatura (50ºC) y agitación (150 rpm). Para alcanzar el pH en cada fase se añadió HCl y NaOH (1 N). Para finalizar las reacciones enzimáticas, los tubos se calentaron a 85ºC durante 10 min. Las muestras para analizar, tomadas a tiempo final, se centrifugaron a 10.000 g en microcentrífuga, tomándose el sobrenadante con las proteínas y aminoácidos disueltos. Éstas se guardaron en congelador a -20ºC hasta su análisis.

 2.3. Métodos analíticos

   El crecimiento del cultivo de microalgas se midió mediante densidad óptica a 680 nm. Para ello se elaboró una ecuación de regresión lineal a partir de muestras de diferente concentración, determinando el peso seco por diferencia de pesada de los sólidos en suspensión filtrados, según los Métodos Normalizados (Clesceri et al., 1999). El contenido total de proteínas de la microalga se determinó mediante el método Slocombe et al. (2013). El rendimiento de los ensayos enzimáticos se evaluó mediante la determinación del contenido de proteínas y amino-nitrógeno libre (FAN por sus siglas en inglés) en el extracto líquido, con el método de Lowry a 750 nm (Lowry et al., 1951), y de la ninhidrina a 570 nm (Abernathy, 2009), respectivamente.

 2.4. Diseño experimental

   Para la optimización del método se empleó un diseño de análisis estadístico de superficie de respuesta de diseño central compuesto rotable (distancia axial: 1.41421) con tres puntos centrales, siendo por tanto el número total de ensayos de 11: 4 experimentos del diseño factorial, 4 puntos axiales y 3 centrales. Se estudiaron dos factores experimentales, el tiempo de la reacción enzimática con celulasa y el pH de la fase de autolisis. Los niveles de los factores se eligieron para cubrir el rango de los óptimos esperados según los estudios previos consultados y de ensayos preliminares (tabla 1). Las variables de respuesta analizadas fueron el contenido en el extracto de proteínas y de amino-nitrogeno libre (FAN), expresados como porcentaje sobre la biomasa de microalgas en base seca. El diseño de los experimentos y el análisis de los resultados se realizaron con Statgraphics Centurion XVII (versión 17.1.08).

Tabla 1. Niveles de los factores empleados en el diseño experimental.

3. Resultados y discusión

 3.1. Ajuste de los modelos y análisis de las superficies de respuesta

   La influencia del tiempo de la reacción enzimática con celulasa y el pH de la fase de autolisis se estudiaron según el diseño central compuesto descrito antes. A partir de este diseño se obtuvieron dos modelos para cada variable de respuesta analizada:

• Proteínas (%) = -31,6643 + 2,41204*t + 9,85206*pH - 0,377696*t^2 + 0,0253884*t*pH - 0,587666*pH^2
• FAN (%) = -0,706503 + 0,0196583*t + 0,24331*pH - 0,00472136*t^2 + 0,0010037*t*pH - 0,0150843*pH^2

   Ambos modelos proporcionaron un buen ajuste según los estadísticos obtenidos. De este modo, los coeficientes de regresión (R²) fueron de 0,982 (proteínas) y 0,949 (FAN), y la R² ajustada de 0,963 (proteínas) y 0,897 (FAN). Los estadísticos de Durbin-Watson fueron de 2,4988 (p=0,7133) y 2,10294 (p=0,4022). En el caso del modelo de proteínas, 4 efectos tienen un p-valor menor que 0,05, indicando que su efecto es significativo para un nivel de confianza del 95,0%, mientras que para FAN, el número de efectos significativos fue de 2. En el diagrama de Pareto de la Fig. 1 se muestra de forma gráfica los efectos principales e interacciones dobles.

Fig. 1. Diagramas de Pareto mostrando el efecto del tiempo de la reacción enzimática con celulasa (t) y el pH de la fase de autolisis para la obtención de proteínas (izquierda) y FAN (derecha).

   El análisis de la superficie correspondiente a proteínas reveló que el tiempo y el pH tuvieron un efecto notable en la curvatura de la superficie de respuesta (Fig. 2). Estas alcanzaron el máximo a t=3,5 h y pH=8,5. En cambio, en el caso de FAN solo el pH tuvo un efecto significativo en la curvatura, alcanzando su máximo a t=2,9 h y pH=8,2.

Fig. 2. Gráficas de superficie de respuesta mostrando el efecto del tiempo de la reacción enzimática con celulasa (t) y el pH de la fase de autolisis para la obtención de proteínas y FAN (% sobre materia seca).

 3.2. Validación del modelo

    Para validar el modelo se realizó un ensayo por triplicado bajo las condiciones que maximizaban las dos variables de respuesta: 3,3 h y pH 8,3. En este ensayo se obtuvieron unos rendimientos del 14,4±0,89% en proteínas y del 0,33±0,011% en FAN, ajustados a los valores previstos. El rendimiento de extracción sobre el total de proteínas fue del 44,2%, considerando un contenido total en la biomasa del 32,6%.

   Comparado con otros estudios, los rendimientos obtenidos fueron inferiores. Safi et al. (2014) obtuvieron con la misma especie un rendimiento en proteínas del 26,2% mediante homogenización a alta presión. Morris et al., 2008 alcanzaron el 26,8% mediante el tratamiento enzimático con pancreatina de un extracto etanólico de C. vulgaris. En este último caso alcanzaron un rendimiento en FAN del 2,4%, notablemente superior al obtenido mediante autolisis. Dado este bajo rendimiento en FAN, resultaría interesante para estudios posteriores sustituir la autolisis por una reacción con enzimas proteolíticas, tras la ruptura de la pared con celulasa. Concretamente, las enzimas comerciales Alcalase y Flavourzyme (Novozymes) han proporcionado buenos resultados en anteriores estudios (Romero García et al., 2012).

   El empleo de celulasa demostró ser válido para la disrupción celular dada la liberación de proteínas alcanzada. Esta enzima ha sido empleada con éxito en otras investigaciones con C. vulgaris (Cho et al., 2013; Zheng et al., 2012, 2011). Por el contrario, Gerken et al. (2013) señalaron la carencia de celulosa en esta especie en un estudio con diferentes enzimas, en el que obtuvieron los mejores resultados con lisozima. Sin embargo, en el mismo encontraron una acción mayor empleando lisozima y celulasa, comparado con lisozima solo, indicando que podría contener pequeñas cantidades de celulosa o polímeros que la celulasa podría hidrolizar.

4. Conclusiones

   Se ha optimizado un método de obtención de un extracto rico en proteínas y aminoácidos libres basado en la autolisis de C. vulgaris, previa ruptura de la pared celular mediante un método enzimático con celulasa. Para esta optimización se empleó un diseño de análisis estadístico de superficie de respuesta de diseño central compuesto. El método propuesto permitió obtener unos rendimientos en la obtención de proteínas y FAN superiores al 14% y 0,3%, respectivamente, sobre biomasa seca. Sin embargo, el bajo rendimiento obtenido especialmente en el caso de los FAN sugiere la necesidad de añadir una fase enzimática con enzimas proteolíticas.

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